通腑宁颗粒对免疫法复制大鼠UC动物模型影响的实验研究
田振国 辽宁中医药大学肛肠医院（110003）
摘要:目的 研究通腑宁颗粒对慢性非特异性溃疡性结肠炎的治疗作用。方法 通腑宁颗粒对免疫法复制大鼠溃疡性结肠炎动物模型的影响，来观察其治疗效果。结果 通腑宁颗粒对免疫法复制溃疡性结肠炎动物模型具有免疫调节作用。结论 通腑宁颗粒可通过调整免疫功能实现对慢性非特异性溃疡性结肠炎的治疗作用。
通腑宁颗粒原名为加味通腑汤，由胡黄连、黄柏、滑石、芦根、天花粉等13味中药组成，具有通调气血、清热利湿、通腑止泻功效。主治湿热型慢性非特异性溃疡性结肠炎，疗效满意。本方是笔者的临床经验方，自1991年起即在辽宁中医肛肠医院作为院内制剂使用， 1999年在保持原方药物构成不变和剂量配比不变的情况下，改剂型为颗粒剂，现已申报国家三类中药新药。
慢性非特异性溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis, UC）是一种原因不明的慢性非特异性炎症性肠病，临床上以腹痛、腹泻、粘液血便为主要症状。本病一般呈慢性迁延过程，常反复急性发作。我国近年发病率有显著增高趋势。原因不明，一般认为本病与免疫机制有关。在临床上本病可并发中毒性结肠扩张、肠穿孔、大出血、假性息肉、癌变；肠道外可并发关节炎、皮肤病变、眼病、肝胆病变、尿路结石、间质性肺纤维化、血栓栓塞症、动脉炎等。在治疗上目前西医多采用静脉营养法、抗生素、激素、免疫抑制剂、生物制剂等，但直至目前对本病的病因病理尚未明了，临床疗效尚不够理想。
中医学认为UC属于“泄泻”、“痢疾”、 “腹痛”等范畴，患者常由于先天禀赋不足，后天脾胃功能不健，在感受外邪，饮食所伤，情志不遂等致病因素作用下而诱发。目前认为其发病病机是脾虚为本，大肠湿热为标，血瘀为局部病理损害。为评价通腑宁颗粒的药理作用，进行了通腑宁颗粒对免疫法复制大鼠UC动物模型的影响实验。
1 实验材料
1.1 实验动物 Wistar大鼠74只，雌、雄各半，体重150-220克；新西兰家兔4只，体重2-3公斤。动物均由中国医科大学实验动物中心提供，合格证号辽实质合字第008号，辽实条合字第001号，试验前于辽宁省中医研究院动物观察室适应性饲养一周后使用，合格证号辽实条合字第016号。
动物饲料 鼠颗粒饲料，于洪区前民饲料厂生产；兔颗粒饲料，于洪区前民饲料厂生产。
饲养环境 辽宁省中医研究院动物饲养观察室，室内洁净、安静、自然采光，通风良好，湿温度适中。
饲养方法 按组分笼饲养，大鼠每笼5只，兔每笼2只，自由进食进水。
1.2 实验药物及试剂
通腑宁颗粒（辽宁省中医研究院制剂室提供，批号990425，规格7.5克/袋）；香连化滞丸（包头中药厂生产，批号：20000110，规格：6克/丸）；柳氮磺吡啶片（上海三维制药有限公司生产，批号：200011015，规格：250毫克/片）；卡介苗（长春医学生物制品研究所，批号：200010003，规格：60毫克/支）；无水羊毛脂（防化学院实验化工厂，批号：981101）；氟化钠（丹东市联合制冷剂厂，批号：950601）；硼砂（沈阳市制剂三厂，批号：991010）；硼酸（沈阳市制剂三厂，批号：991201）；PEG6000（防化学院实验化工厂，批号：950615）。
2 实验方法
取体重180-220克大鼠74只，雌雄各半，随机分为造型组（64只）和空白对照组（10只），取4只家兔（雌雄不拘），剖腹取全结肠，清水洗净后刮取肠粘膜，加20ml生理盐水，匀浆器匀浆后，离心30min（3000r/min），取上清液。以上清液溶解卡介苗制成10mg/ml溶液。另取无水羊毛脂及液体石蜡，以3：5比例配成佐剂，高温高压灭菌后备用。取佐剂和粘膜上清液卡介苗溶液按1：1比例制成含卡介苗5mg/ml的粘膜匀浆，即抗原。冰箱冷藏。造型大鼠首次每只足跖酒精棉球局部消毒后注射抗原0.4ml，于第10、17、24、31天分别于足跖、背部、腹股沟、腹腔内每只动物以同样剂量注射，但末次注射不加佐剂。造型期间观察大鼠大便性状，厌食与否，毛发，活动状况等，造型时间为40天。从造型组中取4只大鼠，处死，取出结肠做病理学检查，确定造模成功。将造型大鼠随机分成6组，每组10只，分别为通腑宁颗粒高、中、低剂量组；香连化滞丸组；柳氮磺吡啶组；模型组。各组动物按表6的剂量灌胃给药，空白对照组与模型组则灌胃给予同体积生理盐水。连续灌胃给药3周，每天1次。实验结束时，禁食1天，大鼠摘眼球取血后脱颈处死，于距肛门5cm处剖取结肠组织，置10%甲醛溶液中固定。将进行组织病理学检查，血液取血清后备用。采用PEG法测循环免疫复合物。先取4.29克硼砂（Na2B4O2·10H2O），3.40克硼酸（H3BO3），蒸馏水加至1000毫升，溶后用G3号玻璃滤器过滤，即配制成0.1mol/L，PH8.4硼酸盐缓冲剂（BB）。取40.9克PEG6000，10.0克氟化钠（NaF），BB加至1000毫升，溶后用G3号玻璃滤器过滤，即配成PEG-NaF稀释液。取待检血清0.15毫升，加BB 0.3毫升（即1：3稀释）。取BB 2.0毫升加入对照器，取PEG-NaF稀释液2.0毫升加入测试管，各取0.2毫升1：3稀释检样，分别加入测试管和对照管，加入各液后（待检血清最终稀释倍数为1：33，PEG最终浓度为36.4g/L），于37℃恒温箱中水浴60分钟。取出后，用分光光度计在波长495nm处测吸光度。计算待检血清浊度值[待检血清浊度值=（测定管吸光度-对照管吸光度）×100]。
3 结果与分析
（1）免疫法复制UC模型动物的观察
造型动物于1周左右出现粘液稀便。2周左右更严重，可见脓血，消瘦，食欲减退，毛不光洁，懒动等。经给药后通腑宁高、中、低剂量组，香连化滞丸组与柳氮磺吡啶组均有不同程度的改善。
（2）通腑宁颗粒对免疫法复制UC动物模型免疫功能的影响
表6 通腑宁颗粒对免疫法复制UC动物模型免疫功能的影响
|
组 别 |
动物数（只） |
剂量（g/kg） |
循环免疫复合物（CIC） |
|
空白对照组
模 型 组
通腑宁颗粒高剂量组
通腑宁颗粒中剂量组
通腑宁颗粒低剂量组
香连化滞丸组
柳氮磺吡啶组 |
10
10
10
10
10
10
10 |
—
—
8.10
4.05
2.03
6.48
0.32 |
0.018±0.004
0.048±0.021**
0.023±0.012
0.030±0.017*
0.036±0.020*
0.034±0.018*
0.040±0.016** |
与空白对照组相比 *P<0.05 **P<0.01
由表6可见，模型组、通腑宁颗粒中剂量组、通腑宁颗粒低剂量组、香莲化滞丸组、柳氮磺吡啶组未将CIC值恢复到正常范围，同空白对照组相比具显著性差异，而通腑宁颗粒高剂量组则将其恢复到正常范围，同空白对照组相比无显著性差异，说明通腑宁颗粒高剂量组具有免疫调节作用。
（3）通腑宁颗粒对免疫法复制UC动物模型影响的病理结果
空白对照组可见肠粘膜腺体大小、形态一致，排列规整，粘膜表面上皮完整。模型组可见肠管上皮脱落，局部形成明显深溃疡，肠壁及溃疡底部血管充血明显，大量炎性细胞浸润。通腑宁颗粒高剂量组可见溃疡处被增生的粘膜腺体所充填，腺体大小、形态一致，排列规整，形态接近正常肠粘膜，血管极轻度扩张充血，周边少量炎细胞浸润。通腑宁颗粒中剂量组溃疡处粘膜腺体增生较明显，部分溃疡所致肠粘膜缺损被充填，呈中度溃疡形态改变，血管轻度扩张充血，周边少量炎细胞浸润。通腑宁颗粒低剂量组可见溃疡处粘膜腺体增生不明显，局部溃疡明显可见，偶见小脓包，上皮明显缺损，溃疡底部血管充血，炎性细胞浸润。香连化滞丸组可见溃疡处粘膜腺体增生接近通腑宁颗粒中剂量组改变，溃疡底部及肠壁血管充血，炎细胞浸润。柳氮磺吡啶组可见溃疡处腺体再生明显，大小、形态一致，排列规整，表层呈表浅溃疡改变，粘膜上皮缺损，血管轻度扩张充血，周边少量炎细胞浸润。
4 通腑宁治疗实验性UC的结果评价
免疫因素在UC的发病中的地位日益受到重视，故对其研究是有必要的，且模型的复制是成功的。经通腑宁颗粒高剂量组治疗后病理结果显示：溃疡处被增生的粘膜腺体所充填，肠粘膜腺体大小、形态一致，排列规整，形态接近正常的肠粘膜，说明通腑宁颗粒对免疫法复制UC模型的病变肠段有很好的治疗修复作用。除应考查其组织学变化外，为探讨作用机制，还应监测其免疫指标的变化。由于免疫复合物的检测对于判定疾病活动性、治疗效果、预后及探讨发病原因有重要意义，某些自身免疫性疾病可检出循环免疫复合物。故选用该指标。实验结果表明通腑宁颗粒具有一定的免疫调节作用。说明其治疗与调节免疫机能有关。由于通腑宁颗粒组成中补益药物较少，而一般认为调节免疫功能的药物多为补益药，故其对免疫功能的调节可能与祛除致敏物，或阻断了免疫反应的某个环节有关，应增加免疫指标以便进行更深入探讨，此待以后继续进行。
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