顽固性便秘家兔结肠旷置术前后Cajal细胞数量及超微结构研究

徐爱忠，彭洪云，汪庆余，方路

【摘要】目的：研究在结肠旷置术前后顽固性便秘家兔结肠Cajal细胞数量变化及超微结构改变情况。 方法：将30只健康成年雌性家兔随机分成对照组和实验组，每组15只，对照组正常饲养，实验组制造顽固性便秘模型。造模成功后，两组家兔均行结肠旷置术，再饲养一个月后将所有家兔处死。在手术前后各取一次结肠标本，统计Cajal细胞数量，观察细胞超微结构。 结果：对照组家兔在结肠旷置术前后Cajal细胞数量分别为：2.910.49个 vs 2.940.45个；实验组家兔在结肠旷置术前后Cajal细胞数量分别为：2.540.35个 vs 2.990.39个。进行统计学分析后，认为结肠旷置术后家兔结肠Cajal细胞数量多于结肠旷置术前（P=0.014）；与对照组相比，实验组家兔手术后结肠Cajal细胞数量比手术前增多更明显（P=0.029），平均每个神经丛多0.45个。 结论：顽固性便秘家兔的结肠Cajal细胞数量明显减少，并伴有形态学变化，但这很可能是一种继发性损害；结肠旷置术作为一种治疗顽固性便秘的外科手术方式，有一定的理论依据。

【关键词】顽固性便秘;结肠旷置术；Cajal细胞

Research about the number and ultramicrostructure of ICCs before and after Colonic Exclusion in Constipated Rabbits XU Ai-zhong, PENG Hong-yun, WANG Qing-yu, FANG Lu. Department of General Surgery, the Second Affiliated Hospital, Nanchang University, Nanchang 330006, China.

Corresponding author：XU Ai-zhong Email:xuaizhong2004@yahoo.com.cn

【Abstract】Objective To study the change about number and ultramicrostructure of colonic ICCs before and after colonic exclusion in constipated rabbits. Methods Thirty female rabbits were randomly divided into control group and treatment group. Fifteen cases in control group were bred normally and fifteen cases in treatment group were used to establish the model of refractory constipation. All of them underwent colonic exclusion after we established the model successfully. A month later all the rabbits were killed. A colonic specimen was taken to count the number and observe the ultramicrostructure of ICC before and after colonic exclusion. Results In control group the number of ICCs in single nerve plexuses was 2.91±0.49 before operation and 2.94±0.45 after operation. In experiment group the number of ICCs in single nerve plexuses was 2.54±0.35 before operation and 2.99±0.39 after operation. They were analyzed with SPSS 12.0 statistical package. The number of colonic ICCs after colonic exclusion was more than the number before colonic exclusion (P=0.014). Comparing with control group, the number of colonic ICCs after colonic exclusion in treatment group increased much more (P=0.029). It increased almost 0.45 for every nerve plexuses in average.

Conclusion The number of colonic ICCs in constipated rabbits decreases obviously and it is accompanied by the change of morphology. But probably it is a secondary

本课题受江西省自然科学基金资助（项目编号：0540148）

作者单位:330006 南昌，南昌大学第二附属医院普外科（徐爱忠，彭洪云，方路），病理科（汪庆余）

通讯作者：徐爱忠，Email:xuaizhong2004@yahoo.com.cn

lesion. As a surgical method to treat refractory constipation, colonic exclusion has itself rational basis. 

【Key words】Refractory constipation; Colonic exclusion; Interstitial cell of Cajal

Cajal细胞（interstitial cell of Cajal, ICC）是由西班牙神经解剖学家Cajal在100年前，首次在消化道肌肉层观察到。他当时描述了ICC的形态结构，发现它们在肠道内源性神经系统末梢发挥作用。后来人们进一步研究发现它们是胃肠道起搏细胞，胃肠动力障碍性疾病与它们的数量和形态学异常有关。顽固性便秘作为最常见的胃肠动力障碍性疾病之一，其发生、发展也与ICC紧密相关。顽固性便秘人体内结肠ICC明显减少，国内外已有相关报道。本实验通过分析结肠旷置术前后家兔结肠壁内ICC形态和数量变化，进一步探讨顽固性便秘的病因，为临床上实施并推广结肠旷置术提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要器材和试剂 健康成年雌性中国本兔30只，体重2.0Kg～2.5Kg，由南昌大学医学院动物科学部提供；碘化锌(分析纯)：国药集团化学试剂有限公司（F20050704）；锇酸:购自江西省医学科学研究所电镜室；Olympus BX41型光学显微镜；日立H-600型透射电子显微镜。

1.2 实验方法 将30只家兔随机分成两组，每组15只，均单笼饲养,保持适宜的生活环境(18～25℃，相对湿度50%～75%,清洁安静)。实验组行手术制造模型，对照组正常饲养。实验组成功建立顽固性便秘的家兔模型后，所有家兔施行结肠旷置术（见图1），再饲养一个月后将家兔处死（见图2）。手术前后各取一小段结肠标本，在光镜下统计ICC数量，在电镜下观察细胞超微结构

1.3 结肠旷置术的手术过程  打开兔子腹腔后，在腹腔中寻找到盲肠，仔细观察小肠、结肠与盲肠的位置关系，以及近端结肠的血液供应。在两个结肠主供血管之间，靠近血管弓远端处切断、结扎血管，保留近端血管供应。在距盲肠端约6～8cm处切断结肠，取一小段旷置的结肠标本检测ICC。用碘伏消毒结肠残端后，远端结肠关闭，荷包缝合包埋，使结肠旷置于腹腔。将近端结肠逆时针拉至盆腔，与直肠行端侧吻合。仔细观察吻合口有无漏气现象，确保吻合口正常后，逐层关闭腹腔。

1.4 碘化锌-锇酸(zinc iodide-osmic acid, ZIO)染色 参照Christensen等法^[1], 将2%锇酸与3%碘化锌按1：3混合,两者均新鲜配制,新鲜混合，制成碘化锌-锇酸溶液。取一段家兔结肠的肠管(旷置部分),长约1.5cm,生理盐水冲去肠内容物,放在滤纸上吸干后，置入ZIO溶液中作用18~30小时(室温,避光),蒸馏水冲洗1~2小时,然后制作石蜡切片观察。

1.5 Cajal细胞计数方法 在光镜下（20×20），随机选取5个肌间神经丛(见图3)，分别统计每个神经丛内ICC个数，然后求这5个神经丛内ICC的均数，作为该家兔单个结肠神经丛内ICC数目。

1.6 电镜标本制备方法 取一段家兔结肠肠管，生理盐水洗净后，切成1×2 mm的条，放在滤纸上吸干、铺平,放入2.5%戊二醛中固定3h后，用0.1M PBS漂洗3次，每次15min。再放入1%锇酸中固定12h，然后用蒸馏水漂洗1次，约15min。依次用乙醇和丙酮梯度脱水后，将标本用国产树脂包埋。修块后进行肌间神经丛定位，然后进行超薄切片，进行醋酸铀、枸橼酸铅双染色，用透射电镜观察。

1.7 统计学处理 所有实验数据用“均数±标准差”表示，录入SPSS 12.0统计软件包,采用前后测量设计的方差分析进行统计学分析。P﹤0.05表示差异有显著性意义,P﹤0.01表示差异有极显著性意义。

2 结果

2.1 光镜下Cajal 细胞的确认 据文献报道,我们从以下特征确认ICC^[2]:①核大,呈圆形或卵圆形,核周胞浆少;②核周胞浆向不同方向发出2～5条长突起,可有二级分支;③细胞的胞体或其发出的突起与神经元关系密切,但不相连;④与神经细胞鉴别：神经细胞的胞体比ICC大，多形性，胞核不明显，突起少而短。

2.2 Cajal细胞的数量变化 在结肠旷置术后，对照组和实验组家兔各死亡1只，死因分别为：肠梗阻和胃穿孔，将剩下28只家兔进行ICC数量的比较。对照组家兔在结肠旷置术前后，单个肌间神经丛内ICC数量分别为：2.91±0.49个 vs 2.94±0.45个；实验组家兔在结肠旷置术前后，单个肌间神经丛内ICC数量分别为：2.54±0.35个 vs 2.99±0.39个（见表3.2）。用SPP12.0统计软件进行方差分析，认为结肠旷置术前后家兔结肠ICC数量不同（F=6.923, P=0.014﹤0.05），术后家兔结肠ICC数量多于术前；实验组家兔和对照组家兔在手术前后，结肠ICC数量变化大小不同（F=5.346, P=0.029﹤0.05），实验组家兔手术后结肠ICC数量比手术前增多更明显，平均每个神经丛多0.45个。

2.3 Cajal细胞的超微结构改变 在透射电子显微镜下，对照组家兔结肠ICC紧邻神经丛，胞体及突起的细胞质内含丰富的线粒体、滑面内质网和发育良好的高尔基氏器,有胞膜窖,核糖体丰富,有大量中间丝和微丝。相邻的ICC之间或ICC与平滑肌细胞间有大量的缝隙连接(见图4)。与对照组相比, 手术前实验组结肠ICC内线粒体肿胀,内质网轻度扩张,有自噬性空泡形成，胞膜窖及缝隙连接明显减少(见图5)。手术后实验组结肠ICC内自噬性空泡消失，线粒体及滑面内质网基本恢复正常，胞膜窖增多，与周围神经有较紧密的缝隙连接(见图6)。